La historia de este monasterio esta influida por numerosos cambios y adaptaciones provocadas por diferentes acontecimientos históricos y relaciones entre diferentes casas de la orden.

El inicio de la existencia del monasterio no esta claro aunque en varias fuentes se da como año de fundación el de 1150. Fue poblado por religiosas que provenían del Monasterio de Santa María de Carbajal, en la provincia de León.

Recibieron apoyos importantes en los primeros años, principalmente de reyes de Castilla como Alfonso IX que les otorgó algunos privilegios confimados después por Fernando III. En 1256 la ciudad de Salamanca sufrió una de las terribles crecidas del rio Tormes que afectó al monasterio llegando a destruir documentos como las propias escrituras de la casa. Para compensar la pérdida, el rey Alfonso X confirmaría su propiedad y los privilegios anteriores.

Los bienes de los que vivían las hermanas de Salamanca pertenecían a las de Carbajal por lo que jerarquicamente dependían de ellas. La abadesa de Santa Ana era nombrada por la de Carbajal lo que generaría durante muchos años serios conflictos.

Durante la reforma de la orden en la península a finales del siglo XV e inicios del XVI, llevada desde San Benito de Valladolid, las religiosas de Carbajal sufireron grandes presiones que trasladaban a la casa de Salamanca. Esto incrementó los enfrentamientos entre las habitantes de Santa Ana. Algunas de ellas venían de León y el resto pertenecían a la ciudad de Salamanca. Muchas mujeres de la ciudad que querían entrar en religión rechazaban este monasterio por la influencia leonesa al que estaba sometido.

Para reducir los conflictos tanto con la orden como con el propio monasterio de Salamanca, finalmente, el 26 de octubre de 1556, la abadesa de León decidió darles la independencia legal para que pudieran autogestionarse.

En 1422 había arrasado la ciudad de Salamanca una nueva crecida del río Tormes. El monasterio, al estar junto a la orilla, volvió a ser uno de los mas dañados. En ese momento y por miedo a las consecuencias que podría provocar una nueva crecida, un prelado se dedice a trasladar a las religiosas dentro de la ciudad. Les cede para vivir la Ermita de Santa Ana en la antigua calle Génova. Las monjas compran algunas casas contiguas a la ermita y levantan el nuevo convento. En ese momento abandonan su antigua advocación de Santa María de Serna (por ser el nombre del prado donde se ubicaba el antiguo monasterio) para adoptar la de Santa Ana. La misma calle adquiriría este nombre desde entonces.

El monasterio, a partir del siglo XVI, se mantiene independiente y en su nueva ubicación y así permanecen hasta principios del siglo XIX.

Sería con la invasión francesa durante la Guerra de Independencia cuando se decide el futuro del convento. Las tropas invasoras destruirían el convento y la misma calle de Santa Ana. Sus religiosas se vieron obligadas a instalarse inicialmente en el Colegio de Santa Cruz hasta que, poco después, se trasladaron definitivamente a la casa benedictina de Alba de Tormes dejando abandonado el convento ya convertido en ruinas.