Nos encontramos ante uno de los conventos más importantes de Castilla la Mancha, íntimamente relacionado con Isabel I de Castilla y uno de los principales representantes del estilo hispanoflamenco, o gótico isabelino, aquel que reune características mozárabes y de gótico final.

En 1476 la reina Isabel compró en Toledo unas casas a Pedro Núñez de Toledo y a Francisco Núñez para crear un nuevo monasterio franciscano en Toledo, acorde con los aires de renovación que se respiraban esos tiempos. Fue el mismo año en que se produjo la batalla de Toro, en la que los Reyes Católicos vencieron a los portugueses, que apoyaban a Juana la Beltraneja, aspirante a la sucesión de Enrique IV.

Así pues, tenemos tres factores que explican la creación del convento: conmemorar la victoria de Toro, crear un monasterio franciscano de la observancia que se opusiero a los otros franciscanos afincados en Toledo, los conventuales de San Francisco y finalmente, ser sitio de enterramiento para los reyes, cosa que finalmente no ocurrió. La reina establece en Real Cédula de 22 de febrero de 1477 dirigida a Juan Tolosa, custodio de Toledo, que quiere construir una casa y monasterio franciscano de la observancia dedicado a San Juan, por el que siente una gran devoción.

Los encargados de dirigir las obras serían el arquitecto Juan Guas, figura principal en gótico toledano y el escultor Egas Cueman, hermano del maestro Hanequin de Bruselas. En 1486, cuando Cisneros llegó a Toledo, ya vivían los franciscanos dentro de San Juan, estando la obra prácticamente terminada diez años después. Y aunque Juan Guas muere en 1496, la obra termina en 1505 gracias a los yernos del arquitecto Luis de Aguirre y García Pérez de Roxas, junto a los maestros Enrique y Antón Egas.

El convento fue testigo de grandes funerales de personajes importantes de la época, como el funeral en tiempo de los Reyes Católicos, de Arturo de Gales, hijo de Enrique VII, desposado con Catalina de Aragón. Aunque en un principio Isabel iba a ser enterrada aquí, finalmente optó por descansar en Granada, no obstante de camino a Granada, los restos fueron recibidos en San Juan de los Reyes. Otro funeral famoso es el de la emperatriz Isabel de Portugal, fallecida en 1539.

San Juan de los Reyes, fue un centro de gran actividad religiosa, donde se llegó a celebrar el Capítulo General de la Orden de Santiago, presidido por el propio Felipe II, maestre de todas las órdenes. Pero los dos hechos religiosos más importantes que se dieron en el convento, fueron la solución al problema entre conventuales y observantes, a raiz de una cédula firmada en Granada por Isabel, el 15 de diciembre de 1500 y de un decreto de la Custodia de Toledo de 1501, por el que se estipula el traslado de los claustrales de San Francisco al nuevo monasterio de San Juan.

El otro hecho clave que se dió en el convento, es la difusión de el inmaculismo, teoría franciscana sobre la ausencia de pecado original en el nacimiento de la Virgen María, de la que la reina Isabel era una gran seguidora. San Juan de los Reyes fue uno de los principipales centros de difusión de la península. Al quedar vacio el convento de San Francisco, se decretó que lo ocuparan las Concepcionistas de Beatriz de Silva, gran protegida de la reina Isabel y de los franciscanos. Cisneros que había sido fransicano en San Juan Reyes, antes de ascender a la mitra toledana en 1495, creo la cofradía de la Pura Concepción de la Virgen Nuestra Señora, dedicada a honrar las tesis inmaculistas. Incluso en 1615 los profesores de la Escuela de Teología de San Juan de los Reyes, clavaron en la puerta de la iglesia las tesis inmaculistas. En general se puede decir que muchos de los capítulos franciscanos celebrados en San Juan de los Reyes, se emplearon para ensalzar estas ideas.

El 19 de diciembre de 1808, las tropas de los ejércitos napoleónicos, incendian en Toledo varios conventos, entre ellos San Juan de los Reyes. El convento vuelve a abrir sus puertas con la restauración, en 1832, con 23 frailes y el convento en estado de ruína. En 1827 comienzan las obras de rehabilitación, pero en 1835 el convento cierra definitivamente sus puertas al aplicarse la exclaustración decretada por Mendizábal. No obstante debido al gran interés artístico del convento, en 1881, Jose Luís Alvareda, Ministro de Fomento, encarga su restauración. En 1883 se declara monumento nacional, aunque pasan los años y el convento no se rehabilita. Hasta 1941 año en que se devuelve el convento a la orden franciscana.