La fundación de el convento de La Aguilera tiene su origen en el franciscano reformador Pedro de Villacreces, fraile del convento de La Salceda (Guadalajara), que partió junto a su pupilo Pedro Regalado hacia La Aguilera (Burgos) para fundar un convento en el que instaurarían una visión reformada de la vida monacal, que por aquel entonces estaba en crisis debido a la relajación de la disciplina conventual. Villacreces contaba con la autorización del obispo de Osma, y así, en 1404 fundó el convento de La Aguilera en una antigua ermita. El 24 de septiembre 1409 el papa Alejandro V expide la bula "Ordinem Fratum Minorum" por la que confirma la reforma iniciada por Villacreces.

Allí permanecen Villacreces y Regalado hasta 1415, año en que parten para fundar un nuevo convento en El Abrojo (Laguna de Duero). Allí Pedro Regalado ejerce de maestro de novicios. En el año 1422 muere Pedro de Villacreces, por lo que, en los años siguientes Pedro Regalado ve reforzada su figura como principal referente de los conventos reformistas fundados por su maestro. Así en 1438 mandó construir la iglesia de La Aguilera y en 1441 se convirtió en Vicario de los conventos de El Abrojo y de la Aguilera. Aunque terminó pasando más tiempo en el segundo, lugar más propicio para el retiro y la meditación, donde moriría en 1456.

El convento contó con el favor de varios de los personajes más notables de la época, y muchos fueron los monarcas que lo visitaron. Como ejemplos tenemos la visita que realiza la reina Isabel la Católica a la tumba de Pedro Regalado en 1492, en la que manda construir un sepulcro; la que realiza Fernando el Católico en 1515; la estancia de Carlos I, en 1518, para celebrar la semana santa o la de Felipe II en 1548. También estuvo alojado en el convento el cardenal Cisneros en el año 1517. En ese momento era regente y desde allí preparó el viaje de Carlos I desde Flandes y los movimientos para sofocar la rebelión de Fernando, hermano de Carlos.

En el s.XVII se produce un hecho de gran trascendencia, y es que, en 1683 se realiza la beatificación de Pedro Regalado. También en este siglo, en 1699, el convento sufre un incendio que deja graves desperfectos en el edificio e iglesia, por lo que, en 1706 vuelven a edificarse parte del convento e iglesia. En 1835, el convento cierra definitivamente sus puertas tras la exclaustración decretada por Mendizábal. Aunque en 1887 regresan frailes franciscanos para hacerse cargo del santuario.