Era el hijo mayor de Francisco de Guisa y Ana de Este. Sus abuelos maternos eran Hércules II de Este, duque de Ferrara y Renata de Francia.

Sucedió a su padre en 1563 como duque de Guisa y Gran Maestre de Francia. Luchó contra los turcos en Hungría en 1565, y a su vuelta, se convirtió en uno de los líderes de la facción católica en las guerras de religión contra los protestantes hugonotes. Luchó en las batallas de Saint-Denis, Jarnac y Moncontour.

Disgustado por la Paz de Saint-Germain y por la influencia de los hugonotes y de Coligny, se apartó de la corte. Intentó asesinar a este último, y la tentativa desencadenó la Matanza de San Bartolomé (24 de agosto de 1572), en la que sucumbió Coligny.

Herido en la batalla de Dormans (10 de octubre de 1575), a partir de entonces se le conoció como "Le Balafré" (el Acuchillado). Fue elevado a héroe entre la población católica de Francia por su oposición a los hugonotes.

En 1576 organizó la Liga Católica para luchar contra el protestante Enrique de Navarra, que tras la muerte del duque de Alençon, hermano de Enrique III, se convirtió en el candidato al trono con más derechos. Este hecho provocó su destierro, a lo que él respondió estrechando sus lazos con Felipe II de España (tratados de Joinville en 1584 y Péronne en 1585). Apoyado por Felipe II de España, intentó hacerse con el poder, y después de la victoria de Auneau (1587) trató de arrebatar la corona a Enrique III.

Temeroso de su poder, Enrique III le prohibió entrar en París, obligándole a permanecer en Champagne, pero Enrique llegó a la capital, donde fue recibido triunfalmente por los parisinos. Tras el día de las barricadas de 1588, el rey tuvo que huir de París y nombró a Guisa Lugarteniente del Reino.

El rey le convocó en Blois para los Estados Generales y allí le mandó asesinar. Su hermano Luis II de Lorena, también llamado cardenal de Guisa, fue asesinado al día siguiente. Este hecho fue considerado un auténtico ultraje entre los parientes de Guisa, y sus aliados obligaron al rey a refugiarse al lado de Enrique de Navarra. Enrique III de Francia fue asesinado el año siguiente por el monje Jacques Clément, de la Liga Católica.