La creación de la Audiencia de Panamá fue propuesta por el Consejo de Indias al emperador Carlos V en consulta de 26 de enero de 1536 y creada por Real Cédula de 26 de enero de 1538, habida cuenta las posibilidades que se abrían en el Mar del Sur y la distancia a la Audiencia de Santo Domingo, de la que dependía.

El distrito que abarcaba era inmenso: "la provincia de Tierra Firme, llamada Castilla del Oro, provincias del Río de la Plata, el Estrecho de Magallanes en Nueva Toledo y Nueva Castilla, llamada Perú, el Río de San Juan, Nicaragua, Cartagena y Ducado de Zarabaro." (A.G.I. Panamá, 235, L. 6, F.169-182). Aunque esta situación cambió en pocos años tras la conquista del Perú, que supuso la creación de la Audiencia y Virreinato de Perú, y la extinción de la de Panamá, cuyo distrito jurisdiccional quedó repartido entre una nueva Audiencia, la de los Confines de Guatemala y Nicaragua, y la de Lima.

En 1563 se restablece con los siguientes límites: por el oeste, desde la Bahía de Fonseca al Río Ulúa y por el este, de Nombre de Dios a Cartagena, el Río Darién. El 4 de junio de 1563 se dictan las Ordenanzas para esta nueva Audiencia panameña (A.G.I. Panamá 236, L. 9, F.417-461). No obstante, con el restablecimiento de la Audiencia de Guatemala, Nicaragua, Chiapas, Higueras y Cabo de Honduras, y la Verapaz quedan sujetas de nuevo a ella.

La Audiencia panameña tuvo una vida accidentada, por la pugna entre los oidores y el presidente gobernador, a lo largo de todo el siglo XVII, existiendo periodos de gobierno colegiado y otros de gobierno unipersonal de los presidentes. Pero, además, por Real Cédula de 6 de febrero de 1571, la provincia de Tierra Firme quedaba sometida en gobierno, guerra y hacienda a las órdenes del virrey de Perú.

Tras una primera supresión en 1718, al crearse por primera vez el Virreinato de Nueva Granada, el gobierno y guerra del territorio queda a cargo del gobernador y comandante general de Tierra Firme, con autoridad militar sobre las gobernaciones de Portobelo, Veragua y Darién. En cuanto a la justicia, aunque la supresión de la Audiencia hacía que las apelaciones tuvieran que ir a Santa Fe, dada la lejanía de la capital del Nuevo Reino, se ordenó que se encaminaran a Panamá las apelaciones de los pleitos civiles sustanciados por los gobernadores, que fueran de menor cuantía. Otra particularidad de Panamá en el siglo XVIII es que no se aplicó en esta provincia el régimen de intendencias.