Militar y gran condestable del reino de Nápoles. Ascanio fue hijo de Fabrizio Colonna, I Duque de Paliano (1460 - 1520) y de Inés de Montefeltro (1470 - 1523). En 1518 se casó con Giovanna de Aragón con la que tuvo siete hijos: Fabricio, Marcello, Prospero, Marcantonio, Vittoria, Agnese y Girolama. A la muerte de su padre en 1520 heredó todos sus títulos. Dos años más tarde se trasladó a Roma donde León X le encomendó la guardia del cónclave romano. Tras la elección de Clemente VII en 1523, Ascanio dirigió su fidelidad al partido imperial y se puso al servicio de Carlos V. Participó en la batalla de Pavía (1525) y también en el Saco de Roma (1527). El emperador le recompensó con el título de gobernador de Velletri. Fue hecho prisionero en la batalla naval de Capo de Orso, aunque fue prontamente liberado por el cardenal Pompeo. Sus acciones en beneficio de Carlos V fueron nuevamente compensadas al asociar a su primogénito con el cargo de gran condestable. Más dañinas fueron las acciones promovidas por el nuevo pontífice, Paulo III, quien en su empeño por consolidar la posición territorial de los Estados Pontificios perjudicó seriamente las nuevas posesiones de los Colonna. Pese al apoyo del emperador, sólo la muerte del papa en 1549 le permitió recuperar parte de esos territorios.

Los últimos años de vida de Ascanio Colonna estuvieron marcados por la separación conyugal de su mujer y la paulatina pérdida de favor imperial. Fue su hijo Marcantonio, que decantó su apoyo hacia su madre, el que recogió la estima del emperador, que empezaba a sospechar que Ascanio mantenía contactos con los franceses. Por ello, Ascanio fue arrestado y llevado a la prisión de Castelnuovo donde murió.