El Hospital General, llamado en su momento Hospital General de Santa Catalina, se creó en 1587 como resultado de la concentración hospitalaria de varios centros. Para ello, Felipe II hubo de afrontar la resistencia de diversas congregaciones y órdenes religiosas por lo que hubo de presionar en Roma por mano de su embajador, el conde de Olivares. Finalmente se hizo realidad gracias a la autorización de Gaspar de Quiroga, arzobispo de Toledo, que encargó a Juan Bautista Neroni la organización de la Congregación. Supuso la reunión, entre otros, del Hospital del Campo del Rey, del de Convalecientes, el Hospital de la Pasión (que era de mujeres), el Hospital Amor de Dios y el de San Ginés. Tuvo varias ubicaciones aunque en seguida se trasladó a la zona de Atocha. En el siglo XVIII sufrió diversos proyectos de reforma: el primero, encomendado a Ventura Rodríguez, que no prosperó; si lo hizo el de José de Hermosilla que concluyó Francisco Sabatini. Actualmente los edificios del Hospital General albergan el Real Conservatorio de Música de Madrid y el Museo de Arte Contemporáneo Reina Sofía.

Dotado de sus propias Constituciones en 6 de diciembre de 1589, tuvo varias fuentes de financiación. Felipe II les otorgó los beneficios de la venta de la Gramática de Nebrija; en tiempos de Felipe III se les entregó la sisa de la carne y se les concedió renta anual que fue confirmada por Felipe IV. En tiempos de Fernando VI, el monarca asumió personalmente la deuda del Hospital y les entregó las ganancias de la Plaza y corridas de toros, además de la administración de los Teatros de los Caños del Peral. En 1849 su administración fue asumida por la Diputación de Madrid.

Aunque contó con cátedras de anatomía desde tiempos de Carlos II, cabe destacar la creación en 1780 del Real Colegio de Cirugía y Medicina de San Carlos, que ocupó parte de sus instalaciones.