Fundado por Fray Diego de Sevilla con la promoción de su padre, Nicolas Martínez de Medina, contador mayor del rey Juan II.

El monasterio dependió del Monasterio de Guadalupe hasta su reconocimiento en el Capítulo de la Orden de 1426.

La fama del monasterio fue creciendo durante los siglos XV y XVI ya que sus priores eran árbitros en los enfrentamientos continuos entre la nobleza de la ciudad. Eran albaceas y visitadores del Hospital de San Hermenegildo.

Por este motivo, en el año 1575, Felipe II concede al monasterio el privilegio de impresion de bulas de la Santa Cruzada de las Indias así como de otras obras religiosas. Se convirtieron en una de las primeras imprentas de la ciudad.

El monasterio albergó obras artísticas de gran importancia siendo algunas de ellas la imagen de San Jerónimo Penitente de Pietro Torrigiano (1522-1524), actualmente en el Museo de Bellas Artes de Sevilla, y una serie de cuadros, obras de pintores como Francisco de Zurbarán (al que se le encarga una serie de cuadros sobre la vida del santo, 1639-1647), Juan Valdés Leal (al que se le encarga una serie de 21 cuadros: seis sobre la vida de San Jerónimo, doce sobre frailes notables de la orden y tres de los fundadores de la orden), Francisco de Varela (una tabla con la pintura de la Trinidad, 1625), Juan de Espinal (recibió el encargo de 26 cuadros), o Pedro Duque Cornejo (al cual se le pide que decore con frescos unas paredes del monasterio, ya en el siglo XVIII).

Durante el siglo XVII llegó a haber hasta 150 monjes residiendo en el monasterio.

Dada su importancia y prestigio se convirtió en la residencia en Sevilla de personajes importantes, entre ellos los propios Reyes Católicos, Carlos I, Felipe II, Felipe IV o Felipe V.

Ya durante la Guerra de Independencia el monasterio sufrió grandes daños, empezando así su declive. Entre 1815 y 1820 fue saqueado por las tropas en él acuarteladas. En 1823 regresaba la comunidad, pero en 1835 el convento cierra definitivamente debido a la aplicación de los decretos de exclaustración de Mendizabal.

Debió permanecer casi intacto hasta 1843 en que se dio principio a su destrucción sistemática, con la instalación en la iglesia y otras dependencias de una fábrica de vidrio, fundada por su propietario, Enrique Hodson. En 1850 cobijaba una iglesia y cementerio protestantes, el llamado "cementerio de los ingleses". Después aparecen instalados algunos vecinos y un colegio.

En 1964 fue declarado monumento histórico artístico y adquirido por el Ayuntamiento de Sevilla en 1984.