Con las ordenanzas de Córdoba de 1485 y de Medina del Campo de 1489, quedan prefiguradas las salas de lo Civil de la Real Audiencia y Chancillería de Valladolid. En un inicio el número de salas va a ser de dos, en las que se distribuyen ocho oidores, cuatro por sala. En 1499 se va a crear una tercera sala, añadiéndose un oidor al número de oidores, siendo así de tres oidores por sala. La configuración definitiva de las salas de lo Civil se produce por motivo de la visita de Juan de Córdoba en 1542. Aumenta el número de oidores hasta 16, configurados en cuatro salas. Cada dos meses se renovarán los oidores de las distintas salas, siendo presididas por los oidores más antiguos. En cada sala, un oidor semanero, documentado desde 1503, hacía funciones de gestión y administración.

Además de los oidores y del presidente de la Chancillería, las salas de lo Civil contaban con distintos cargos judiciales y oficiales dedicados a su funcionamiento, algunos de los cuales eran comunes al resto de salas de la Chancillería. Así, en el momento de existencia de mayor número de personal, éste se componía de uno de los dos fiscales de la Chancillería, con su agente fiscal, que ejercía sus funciones también en la sala de Hijosdalgo; doce escribanías de las diecinueve existentes, adscribiéndose tres por sala; doce de los diecisiete relatores de la Chancillería; y dos porteros por cada sala.

Comunes al resto de salas de la Chancillería eran el repartidor y tasador de pleitos, los receptores de probanzas y su repartidor, el receptor de penas de cámara; treinta procuradores; veinte agentes; seis contadores; un alguacil mayor; seis alguaciles; y un pagador.

Las salas de lo Civil de la Real Audiencia y Chancillería de Valladolid tenían competencia sobre todos los asuntos del orden civil dentro del ámbito de actuación de la Real Audiencia y Chancillería de Valladolid. Los asuntos que juzgaba podían entrar en primera instancia, los denominados "casos de corte", aquellos que juzgaba directamente el rey por privilegio o por la calidad de alguna de las partes; o por apelación. Los asuntos que juzgaba por apelación eran los siguientes:

- Las sentencias de los distintos tribunales del reino, ya fueran los pertenecientes a la jurisdicción real (alcaldes ordinarios, alcaldes mayores, corregidores, merinos, adelantados, audiencias de Galicia y Asturias) como los pertenecientes a las jurisdicciones especiales (jurisdicción eclesiástica, mercantil y señorial).

- Las sentencias pronunciadas por el tribunal del Juzgado de Provincia, que tenía jurisdicción en el rastro de la Chancillería (área jurisdiccional de cinco leguas alrededor de la sede del tribunal).

- Las sentencias de la sala de Hijosdalgo de la Chancillería, tanto las relativas a hidalgos e hidalguías, como las relativas a alcabalas.

Los distintos asuntos que se juzgaban en las salas de lo Civil se canalizaban en el repartimiento en varios partidos administrativos, según la calidad de las partes y de los asuntos. En el momento de máximo desarrollo normativo de la Chancillería, existían diez partidos generales en los que se canalizaban los pleitos según su cuantía y la calidad de las partes; tres partidos de administraciones; partidos de residencias, competencias, eclesiástico, de villa, de pobres, perdido, menor, y de provisiones que no causan pendencia.

De las sentencias de las salas de lo Civil cabía apelación ante la sala de Justicia del Consejo de Castilla (Sala de las Mil y Quinientas).

Las salas de lo Civil se estructuraban cada una de ellas en tres escribanías. El nombre por el que se conoce cada una de éstas es por el apellido del último escribano que la desempeñó hasta que desapareció el tribunal, ya entrado el siglo XIX. Así, las doce escribanías de lo Civil se las denomina: Alonso Rodríguez, Ceballos Escalera, Fernando Alonso, Lapuerta, Masas, Moreno, Pérez Alonso, Quevedo, Taboada, Varela, Zarandona y Balboa, y Zarandona y Walls.

De forma rotatoria se constituían en escribanos semaneros de la sala de la que dependían, desempeñando funciones administrativas de la sala y de canalización de documentos a las escribanías correspondientes.