Con las ordenanzas de la Chancillería de Valladolid de Córdoba (1485), Piedrahita (1486) y Medina del Campo (1489), quedaba prefigurada la sala de lo Criminal de la Chancillería. Así, en las de Cördoba, en su artículo 4º, se establece una sala formada por tres alcaldes de nombramiento real, con capacidad para conocer de los pleitos criminales tanto por casos de corte como por apelación, repitiéndose estas disposiciones en las ordenanzas de Medina del Campo en su artículo 4º.

En 1554 se estableció de forma definitiva el número de alcaldes en cuatro, aunque fuera normal la existencia de alcaldes supernumerarios.

Por cédula real de 1771 se crea la segunda sala de lo Criminal absorbiendo a la sala de Hijosdalgo, debido al aumento de los asuntos criminales y para conseguir una mayor rapidez y agilidad en su resolución. Dicha segunda sala seguiría estando destinada también al conocimiento de los pleitos de hidalguía, aunque la gran disminución de éstos había motivado su absorción por el Crimen.

Además de los alcaldes, las salas del Crimen contaban con varios cargos judiciales y oficiales dedicados a su funcionamiento, algunos de los cuales eran comunes al resto de las salas de la Chancillería. Así, en el momento de existencia de mayor número de personal, éste se componía de uno de los dos fiscales de la Chancillería, con su agente fiscal, que ejercía sus funciones también en la sala de Vizcaya; tres escribanías de las diecinueve existentes; tres de los diecisiete relatores de la Chancillería; y dos porteros por cada sala.

Comunes al resto de salas de la Chancillería eran el repartidor y tasador de pleitos, los receptores de probanzas y su repartidor, el receptor de penas de cámara; treinta procuradores; veinte agentes; seis contadores; un alguacil mayor; seis alguaciles; y un pagador.

La sala conocía de todos los pleitos criminales del distrito jurisdiccional de la Chancillería, tanto de casos de corte como por apelación de sentencias de las justicias ordinarias. Sus sentencias eran firmes y no se podían apelar ni a las salas de lo Civil ni a ningún tribunal externo.

. La sala tramitaba además las consultas realizadas por las justicias ordinarias de ciertos procesos y sentencias, además de las llamadas causas secretas, tramitadas a través del fiscal.

Los partidos por los que se debían repartir los pleitos criminales vienen reflejados en la Práctica de la Chancillería de Valladolid de Fernández de Ayala Aulestia, y son los siguientes:

- Primer partido: se reparten los pleitos en los que intervienen jueces pesquisidores por nombramiento real, siendo apelados ante la sala del Crimen.

- Segundo partido: se reparten los pleitos de dos o tres partes contra una.

- Tercer partido: se reparten los pleitos de dos partes contra una.

- Cuarto partido: pleitos de los que se presentan personalmente en la Chancillería.

- Séptimo partido: Pleitos de una parte con los oficios de justicia.

- Partido de pobres: pleitos relativos a pobres de solemnidad y los repartidos a petición del fiscal.

- Partido Ninguno: pleitos de la ciudad de Valladolid y de la jurisdicción de las cinco leguas de la Chancillería.

Las salas de lo Criminal se estructuraban en tres escribanías. El nombre por el que se conoce cada una de éstas es por el apellido del último escribano que la desempeñó hasta que desapareció el tribunal en 1834. Así, las tres escribanías se las denomina: Liébana Mancebo, López Julián y Granado.

De forma rotatoria se constituían en escribanos semaneros de la sala de la que dependían, desempeñando funciones administrativas de la sala y de canalización de documentos a las escribanías correspondientes