El Convento de la Encarnación de Madrid se fundó el 16 de abril de 1590 bajo el patronazgo de María de Aragón, hija de Álvaro de Córdoba. Aragón estableció en su testamento la creación de una casa-colegio con 20 religiosos dedicados a la oración y los estudios de teología. El convento se ubicó en unos terrenos cedidos por el rey Felipe II frente al Alcázar de Madrid y su primer prior fue fray Alonso de Orozco. La Corona y los arzobispos de Toledo también otorgaron su protección al convento.

Las obras del edificio se prolongaron durante muchos años debido a varios conflictos entre el convento y algunos nobles con propiedades colindantes. La construcción de la iglesia se ha atribuído erronéamente a El Greco, que sólo contribuyó a la decoración. Los verdaderos arquitectos fueron Juan de Valencia y Francisco de Mora.

En el convento se enseñaban los grados de artes, teología y derecho. A partir de 1679 empezaron a ofrecerse estudios públicos (es decir, abiertos a seglares) mediante dos cátedras de teología escolástica y tres de filosofía. Además, desde 1691 el convento también sirvió como centro de oposiciones a las cátedras de todos los conventos que ofrecían enseñanza en la provincia agustiniana de Castilla. A partir de 1731 el convento dispuso de su propia imprenta. En 1800 se añadió una cátedra de matemáticas.

Durante la Guerra de la Independencia, el convento fue utilizado por los franceses como cuartel. Posteriormente, el Real Decreto de 18 de agosto de 1809 suprimiendo todas las órdenes regulares, monacales, mendicantes y clericales existentes en España confirmó el abandono del convento. Al parecer, una parte del edificio fue derruida y diversas obras de arte y joyas desaparecieron durante el conflicto. Después de que los franceses abandonasen la capital, las Cortes elegidas tras la aprobación de la Constitución de 1812 escogieron el convento como salón de sesiones y tomaron posesión del mismo el 19 de septiembre de 1813.

Sin embargo, después de que el rey Fernando VII aboliese la Constitución en 1814, los frailes regresaron al convento. Entre 1815 y 1820 mantuvieron un conflicto con la Corona, que deseaba expropiar una parte del edificio para convertirlo en parroquia del Palacio Real. Durante el Trienio Liberal (1820-1823) el convento volvió a servir como salón de sesiones de las Cortes y la comunidad fue suprimida por la Ley sobre monasterios y conventos de 25 de octubre de 1820. El 13 de junio de 1823, una vez ocuparon Madrid las tropas francesas que restauraron el poder absoluto de Fernando VII, se autorizó a los frailes a volver a ocupar el convento. Para entonces, sin embargo, el número de religiosos se había reducido a sólo cinco. Finalmente, el Real Decreto de 11 de octubre de 1835 suprimiendo los monacales obligó a los frailes a abandonar definitivamente el convento el 17 de enero de 1836. Desde entonces, el edificio se ha utilizado como sede del Senado.