Los franciscanos descalzos llegaron a Valladolid en 1601, asentándose en unas casas de duque de Lerma en la por aquel entonces llamada calle del Rosario. En 1603 comenzaron las obras del convento, siendo el arquitecto Francisco de Mora y los encargados de la obra Pedro Mazuecos y Diego de Praves. En 1605 la obra estaba muy avanzada y se produjo la consagración de la iglesia.

El convento contó desde el principio con el patronato y ayuda del duque de Lerma, dicha situación se prolongó con sus herederos, que en 1660 siguen constando como patronos. El convento de San Diego estaba situado cerca del palacio real, por lo que su iglesia fue la de la realeza. De hecho, el 14 de mayo de 1690 el convento acogió en el recinto la celebración de la boda del Rey Carlos II con Mariana de Neoburgo.

Con la Guerra de la Independencia, el convento tuvo que cesar su actividad hasta agosto de 1814, fecha en que regresaron los frailes al convento. Allí permanecieron hasta 1835, fecha en que el edifico cierra definitivamente sus puertas tras la exclaustración decretada por Mendizábal. Parte del convento se usó como depósito de libros, y en 1844 parte fue destinado a cuartel de la Guardia Civil.