El Convento de San Nicolás de Tolentino de Valladolid fue autorizado en octubre de 1602 por el obispo de Valladolid, Juan Bautista de Acevedo. En ese momento ya había 45 agustinos recoletos residiendo en la ciudad, pero tardaron varios años en encontrar una residencia fija debido a la oposición de otros conventos y a la insalubridad de sus primeras ubicaciones. Finalmente, el 7 de mayo de 1606 se trasladaron a su localización definitiva en la actual Acera Recoletos. Posteriormente, continuaron adquiriendo casas y solares antiguos. En 1620 se vinculó al convento la cofradía del Santísimo Sacramento y Ánimas. Más adelante, la Real Chancillería de Valladolid adquirió el patronazgo de la capilla mayor de la iglesia. La iglesia, atribuida a fray Lorenzo de San Nicolás, se construyó entre 1649 y 1654, pero el edificio del convento no se terminó hasta el siglo XVIII. El número de frailes osciló entre 24 en el siglo XVII y 44 en el siglo XVIII, aunque descendió mucho posteriormente.

En 1808, durante la Guerra de la Independencia, el convento fue ocupado por las tropas francesas, aunque los frailes convivieron con ellas varios meses hasta que fueron expulsados. El 4 de junio de 1814, una vez acabada la guerra, volvieron a ocupar el convento, aunque el edificio había quedado muy deteriorado. La Ley de monasterios y conventos de 25 de octubre de 1820 suprimió el convento, pero el 18 de junio de 1823 se permitió a los frailes volver a ocuparlo. Finalmente, debido a que en 1835 el convento sólo tenía ocho frailes, el Real Decreto de 25 de julio de ese año suprimiendo los monasteros y conventos con menos de 12 religiosos profesos obligó a abandonarlo definitivamente.