Este convento fue fundado en 1518 por Leonor Lasso de la Vega y Figueroa, hija de Lorenzo Suárez de Figueroa y Mendoza, conocido como Gran Capitán, embajador de los Reyes Católicos en Roma y Venecia. Fue producto del deseo de restituir la Orden de Santa Clara en la capital, extinta en 1507 tras la desaparición del convento homónimo de la ciudad, a causa del paludismo que afectó a su comunidad (debido a su cercana ubicación en las proximidades del río Guadiana) y a la peste que asoló Badajoz.

Su creación fue posible por la bula del papa León X, que estableció la adscripción del cenobio a la jurisdicción de la provincia franciscana de San Miguel. Este nuevo cenobio fue ocupado por la comunidad de clarisas franciscanas que ya existía en la ciudad.

La fundadora del convento ejerció como abadesa durante cuarenta años de forma ininterrumpida hasta su muerte, que se produjo el 17 de abril de 1558. Contó con numerosos donantes y patronos como indican algunas de las lápidas que contiene el presbiterio, entre los que cabe destacar a Cristóbal de Fonseca y su mujer Beatriz Manuel.

Otras personalidades relevantes que marcaron la historia de este convento fueron los monarcas Felipe II y Ana de Austria. En 1580, en su pretensión al trono de Portugal, los reyes se hospedaron en el palacio de los Fonseca y La Lapilla (patronos del cenobio). Durante su estancia en Badajoz falleció la reina y, por deseo expreso del rey, fue enterrada bajo el coro del convento hasta su posterior traslado a la cripta del Real Monasterio de El Escorial.

Por Cédula Real Carlos III acogió el cenobio bajo su protección y la de todos sus sucesores, concediéndole además el título de "Real". Según la abadesa sor María Celina de la Presentación Sosa Monsalve en su libro "Historia del Real monasterio de Santa Ana de Badajoz (1518-1994)", dicha Cédula está fechada en 11 de junio de 1771, y se localiza en el propio archivo del convento de Santa Ana de Badajoz. En cambio, según la Resolución de 16 de marzo de 1988 incoando expediente de declaración como Bien de Interés Cultural a favor del Real convento de Santa Ana de Badajoz, publicado en 7 de junio de 1988 (BOE-A-1988-14036), se indica que la citada Cédula Real data de 1761.

En abril de 1812 la comunidad de religiosas de Santa Ana de Badajoz fue expulsada del convento a consecuencia de la ocupación y revueltas napoleónicas, trasladándose a la Casa de Ordenandos (Padres Paules) que por aquel entonces eran sus capellanes, donde permaneció durante tres años.

Pudo resistir las leyes desamortizadoras de Mendizábal gracias al artículo 5º del Concordato, que libraba del cierre a aquellos conventos y monasterios que tuvieran algún mérito artístico e histórico. En este periodo acogió a otras comunidades de religiosas que fueron expulsadas de sus cenobios, entre los que cabe destacar los de Trinitarias (que permanecieron en Santa Ana de Badajoz durante once años, retornando después a su convento de origen), de la Madre de Dios de Valverde, de Santa Lucía (ambas comunidades de Terciarias Franciscanas Regulares-Isabelas), de Santa Catalina (Agustinas Recoletas) y de Descalzas (Clarisas, que convivieron en Santa Ana de Badajoz durante tres años y tres meses, regresando después a su cenobio), además de otros conventos de la provincia. Las comunidades de religiosas de la Madre de Dios de Valverde, de Santa Lucía y de Santa Catalina terminaron profesando la Regla de Santa Clara, fusionándose en una única comunidad con las religiosas de Santa Ana de Badajoz el 31 de julio de 1857.

Un año antes, en 1856, por iniciativa del Concilio de Trento, el cenobio de Santa Ana fue puesto bajo la jurisdicción del Ordinario local y desde el 27 de enero de 1970, siguiendo las directrices del Concilio Vaticano II, profesó la Regla de Santa Clara de 1253.

Durante la Guerra Civil el convento no logró escapar a las consecuencias del conflicto. El 2 de agosto de 1936 irrumpió en la iglesia un grupo de milicianos, ordenando a las religiosas desalojar el cenobio de inmediato. Desde entonces y hasta el día 21 de agosto del mismo año las religiosas, gracias a la piedad de uno de aquellos milicianos, pudieron salir del convento y refugiarse de forma dispersa en las viviendas de familiares, amigos y bienhechores. Finalmente el citado día 21 de agosto pudieron regresar al convento.

El 18 de octubre de 1975 se unieron a la comunidad de Santa Ana de Badajoz 10 religiosas procedentes del convento de Nuestra Señora de los Dolores de La Parra (Badajoz).

El 16 de marzo de 1988 la Sección de Patrimonio de la Junta de Extremadura de la Consejería de Educación y Cultura acordó incoar expediente de declaración como Bien de Interés Cultural con categoría de Monumento a favor de este Real convento de Santa Ana de Badajoz, que el 18 de abril del mismo año recibió de la Dirección General de Bellas Artes y Archivo del Ministerio de Cultura el código correspondiente a la anotación preventiva del cenobio en el Registro General de Bienes de Interés Cultural, con la referida categoría de Monumento (código A-R-I-51-000005426).

El 2 de agosto de 2007 la comunidad de Santa Ana de Badajoz experimentó otra fusión, con la llegada de 10 religiosas procedentes del cenobio de Nuestra Señora de Gracia de Jerez de los Caballeros (Badajoz). En la actualidad el convento de Santa Ana continúa enriqueciendo su comunidad acogiendo a jóvenes religiosas procedentes de Perú, Colombia y Polonia.

Los escudos reales de la fachada de la iglesia conventual, pertenecientes a las Casas de Austria y de Borbón, se colocaron el 28 de octubre de 1771. Su colocación fue ordenada por Carlos III por Cédula Real de 11 de junio de 1771.

En el interior de la iglesia se conservan importantes obras de arte de esculturas, pinturas y retablos que data de los siglos XVI, XVII y XVIII. Asimismo el templo custodia la imagen de Nuestra Señora de las Virtudes y Buen Suceso, que se encontró en una concavidad de la pared de la Iglesia de los Jerónimos de Madrid durante unas obras de reconstrucción. Dicha talla se entregó al convento de Santa Ana de Badajoz el 21 de noviembre de 1619. Junto a ella se localizaron otras dos imágenes, quedándose una de ellas en Madrid y entregándose la segunda al cenobio de Franciscanas de Trujillo (Cáceres).

Durante la invasión napoleónica la imagen de Nuestra Señora de las Virtudes y Buen Suceso acompañó a la comunidad de religiosas en su expulsión del convento en 1812, que la custodiaron en su refugio en la Casa de Ordenandos durante los tres años que permanecieron allí.