Inicialmente este convento se fundó en 1550 en Villalcázar de Sirga (Palencia), bajo la advocación de Nuestra Señora de la Piedad. Dos años más tarde, en 1552, la comunidad se trasladó a Valladolid con la ayuda de sus patronos y protectores, los condes de Osorno (Pedro Manrique y María de Velasco), que les proporcionó una vivienda provisional hasta su instalación definitiva en unas casas nobles frente a la Chancillería. Dicho lugar fue cedido formalmente a las religiosas en 1585.

En 1595 cambió el patronazgo del convento en la persona de Francisco Enríquez de Almansa (caballero de Santiago y gentilhombre de la Boca de Su Majestad) y su esposa Mariana de Zúñiga y Velasco. Ambos se comprometieron a llevar a cabo la construcción de una nueva iglesia y un nuevo edificio adecuado para la vida conventual, además de entregar una renta anual de 200 maravedíes a cambio de adquirir la capilla mayor para su enterramiento y el de su familia.

A principios del siglo XVII, con el traslado de la Corte a Valladolid, el monarca Felipe III junto con su esposa Margarita de Austria se hicieron cargo del patronato y edificación del nuevo convento e iglesia. Las obras se iniciaron durante la estancia del rey en Valladolid, pero la escritura definitiva de patronazgo no se firmó hasta el 26 de junio de 1615, fecha en que la Corte ya había regresado a Madrid, cambiando entonces la advocación del convento a Nuestra Señora de la Asunción. Las religiosas se trasladaron a su emplazamiento definitivo el 12 de junio de 1616.

En 1628 se efectuaron reparaciones en el cenobio y en 1657 se ampliaron algunas de sus dependencias.

El patronato y protección del convento por parte de la monarquía se mantendría y renovaría de forma sucesiva en las siguientes centurias.

Desde 1974 el convento de las Descalzas Reales de Valladolid fue nombrado Bien de Interés Cultural con la categoría de Monumento Histórico-Artístico Nacional. En la actualidad la comunidad de religiosas continúa ejerciendo su labor en el mismo emplazamiento que se le otorgó en 1616.

El conjunto conventual es obra clasicista de principios del siglo XVII, elaborado por el arquitecto Francisco de Mora bajo la dirección de Diego de Praves, maestro mayor de obras.

En el exterior muestra un aspecto sobrio. Sobre la puerta de acceso de la fachada principal se sitúa una hornacina que contiene una imagen en piedra de la Asunción, obra atribuida a Gregorio Fernández.

La iglesia se construyó en ladrillo sobre un basamento de piedra de sillería. Presenta una sola nave de planta rectangular, con cuatro tamos cubiertos por bóveda de cañón con lunetos, separados por pilastras, y con un crucero con cúpula sobre pechinas. A los pies del templo se localiza un amplio coro. El coro alto está cerrado por un muro-celosía decorado con un gran tríptico similar a un retablo-relicario. La sillería es de nogal, compuesta por 30 sitiales altos y 8 bajos, y está adornada con bolas y gallones barrocos del siglo XVII.

El claustro presenta un cuadrado perfecto en su planta y consta de dos pisos. La planta baja tiene arcos de medio punto sobre columnas toscanas, mientras que la superior se compone de arcos escarzanos, igualmente sobre columnas toscanas. En su centro se sitúa un pozo de piedra con brocal octogonal y con armadura de hierro que sujeta el sistema de poleas.

El refectorio muestra una planta rectangular, está cubierto por una bóveda de arista y se encuentra presidido por un lienzo del siglo XVII que representa la Sagrada Cena. En el lado sur se localiza una escalera que da acceso al claustro alto, donde se encuentra el antecoro y un pequeño museo con relicarios, imágenes de santos y objetos litúrgicos.

En el interior de la iglesia destaca el altar mayor, de orden corintio, en el que se sitúan pinturas de escenas de la vida de la Virgen que fueron realizadas por Matías Blasco, a excepción de la representación de la Asunción que se sitúa en el centro, elaborada por Vicente Carducho. En los laterales se observan dos pinturas del florentino Arsenio Mascagni, discípulo de Jacobo Ligozzi, que representan a San Francisco en contemplación y a Santa Clara.

El retablo mayor se compone de tres cuerpos más el ático, y fue realizado en madera por el ensamblador Juan de Muniátegui, el escultor Gregorio Fernández y el pintor Santiago Morán. Las esculturas del ático datan de 1614 y representan a la Virgen, San Juan, San Francisco, otro santo franciscano y un Crucifijo.

En el crucero hay dos retablos gemelos de principios del siglo XVII que incluyen pinturas de Morán, y en el lado de la Epístola se conserva un púlpito barroco del siglo XVIII, de hierro con tornavoz de madera.

La colección de pintura que actualmente conserva el convento fue un regalo del Ducado de Toscana a la Corte española. Las obras fueron encargadas por Cristina de Lorena, madre de Cosme II de Médici, que estuvo prometido con María Magdalena de Austria, hermana de la reina Margarita. Se trata de 30 cuadros ejecutados por 20 pintores de la escuela toscana que fueron enviados desde Florencia en 1615. El pintor de la Corte, Santiago Morán, fue el encargado de colocarlos con marco apropiado en el convento vallisoletano.