La construcción del monasterio fue un empeño personal de la reina Margarita de Austria con la intención de conmemorar los decretos firmados por su esposo, Felipe III, que ordenaban la expulsión de los moriscos que quedaban en Madrid.

La reina había tenido mucha relación con un convento de agustinas en Valladolid por lo que cedió esta fundación a dicha orden haciendo venir a Madrid a una religiosa de aquel convento para que ejerciera como priora en la nueva casa.

Vivieron las monjas durante un tiempo en el Real Monasterio de Santa Isabel hasta que pudieron ocupar el nuevo monasterio.

En 1611 el propio rey Felipe III, acompañado por el cardenal Sandoval y Rojas, coloca la primera piedra del edificio. Lo haría en el solar que ocupaba la residencia de los marqueses de Pozas a quienes compró la casa para ubicar el monasterio lo más cerca posible del Palacio Real.

Se llegó a construir un pasadizo subterráneo que unía el monasterio con la antigua Casa del Tesoro, ya desaparecida, que era la zona más cercana desde palacio. La intención era crear un acceso cómodo para la reina que la permitiera visitar el monasterio con frecuencia sin causar molestias.

En cualquier caso,la reina falleció en octubre de ese año de 1611 por lo que no pudo ver la obra finalizada.

Sería ya en 1616, el 2 de julio, cuando se hizo la inauguración oficial. Se celebró toda una jornada de fiestas y ceremonias, incluyendo las exequias por la reina fallecida.

El monasterio custodia obras de gran riqueza. Aparte del valor arquitectónico que posee, considerado un ejemplo único del barroco madrileño, cuyas obras y remodelaciones fueron reralizadas por los más importantes arquitectos de la época como Ventura Rodríguez en el siglo XVIII, poseen obras pictóricas de autores como Lucas Jordan, Juan Van der Hammen, Vicente Carducho o esculturas de imaginería de Gregorio Fernández o Pedro de Mena.

Incluso recibieron los derechos sobre unas minas de plata con cuyos beneficios debían construir una arqueta para custodiar el Santísimo Sacramento los jueves santo.

En la actualidad el monasterio sigue estando habitado por las religiosas. Además forma parte del conjunto de monasterios y conventos adscritos a Patrimonio Nacional que se ocupa de su conservación y gestiona las visitas al monumento.