La creación de la Audiencia de Santa Fe tuvo lugar por Real Cédula del Emperador Carlos V de 17 de julio de 1549. Entre las causas para la fundación de esta nueva Audiencia cabría apuntar fundamentalmente la prosperidad y auge económico del Nuevo Reino de Granada así como su extensión, que difcultaba las comunicaciones con la Audiencia de Santo Domingo, de la que dependía.

La jurisdicción de esta nueva Audiencia abarcaba las provincias del Nuevo Reino, Santa Marta, Rio de San Juan, Popayán, Cartagena de Indias y la Guayana o Dorado, en lo que no perteneciera a la Audiencia de Santo Domingo. La imprecisión de los límites se debía a que gran parte del territorio no era aún bien conocido.

Desde su creación la Audiencia abarca territorios cuya jurisdicción era compartida con otras audiencias, y ello ha de tenerse en cuenta porque de estos territorios se halla documentación en cada una de ellas.Tal sucede con las provincias de Popayán y Maracaibo.

Por lo que toca a Popayán, al crearse la Audiencia de Quito por Real Cédula de 29 de noviembre de 1563, se dispone que la gobernación de Popayán, en lo judicial estuviera dividida entre las Audiencias de Quito y Santa Fe, perteneciendo a la jurisdicción de esta última las ciudades de Anserma, Arma, Toro y Cartago. En cuanto a Maracaibo, puede encontrarse documentación en las Audiencias de Santo Domingo, Santa Fe y Caracas.

En cuanto a su estructura, se establece: un presidente, gobernador y capitán general, cinco oidores que sean tambien alcaldes del crimen, un fiscal, un alguacil mayor, un teniente de canciller y los demás ministros necesarios.

Hacia mediados del siglo XVII, los territorios cuyas apelaciones iban a la Audiencia de Santa Fe eran los siguiente: Gobernaciones de Cartagena, Santa Marta (excepto Rio de la Hacha y La Ramada que dependían de la Audiencia de Santo Domingo), Muzo, Antioquia, Mérida, Popayán, Neiva y San Juan de Girón; los corregimientos de Tunja y Mariquita, y las alcaldias mayores de Santiago de la Atalaya, Salazar de las Palmas, las Minas de Mariquita y San Juan de los Llanos. En 1648 se suprimió la gobernación de Muzo y la Palma, pasando la primera al corregimiento de Tunja y la Palma al de Mariquita.

El siglo XVIII contempla una mayor complejidad territorial al crearse el Virreinato de Nueva Granada. En su primera fundación el 27 de marzo de 1717 su jurisdicción abarcaba todo el territorio de la Audiencia de Santa Fe, Maracaibo, Caracas, Guayana y los de las Audiencias de Panamá y Quito, que quedan extinguidas como tales Audiencias (Santa Fe,368 y 542).

El virreinato se instaura definitivamente en 1740, por Real Cédula de 20 de agosto de 1739, y se nombra Virrey, Capitán General y Presidente de la Audiencia de Santa Fe a Sebastián de Eslava. En las instrucciones al virrey se establece que será Presidente de la Real Audiencia de Santa Fe y Gobernador y Capitán General de la jurisdicción del Nuevo Reino de Granada y provincias agregadas, quedando las Audiencias de Panamá y Quito subordinadas al Virrey, si bien la de Panamá se extingue definitivamente el 1751.

A finales del siglo XVIII el Virreinato comprendía las siguientes provincias: Santa Fe, Tunja, Choco, Mariquita, Antioquia, Santa Marta, Cartagena, Neiva, Giron, Los Llanos, Popayán, Quito, Cuenca, Guayaquil, Mainas, Panamá, Veragua, Darien, Portobelo, Rio de la Hacha y ciudad de San Faustino. Cada una de estas provincias comprendía a su vez gobernaciones, corregimientos y tenencias o alcaldías.