La Chancillería de Valladolid contaba desde un primer momento con oficiales responsables de ejercer las funciones relativas a la fiscalía en asuntos criminales, aunque hasta el año 1503 sólo se contaba con un único fiscal para lo civil y lo criminal, apoyado por un agente. A partir de ese momento, la Chancillería contaría con dos fiscales, uno para lo civil y otro para lo criminal.

El oficial responsable de la Fiscalía del crimen era un agobado real nombrado directamente por el Rey y contaba con un agente fiscal de apoyo a sueldo de la Real Hacienda, nombrado por acuerdo de los alcaldes del crimen.

Entras las funciones desempeñadas por la Fiscalía del Crimen, destacan las siguientes:

- Asistir a todas las sesiones donde se administra justicia criminal en defensa del interés público o de la jurisdicción real, aunque las demás partes implicadas desistan de continuar en el proceso.

- Canalizar la tramitación de las consultas de las instancias inferiores a los Alcaldes del Crimen.

- Colaborar con la fiscalía de lo civil en causas graves.

- Comunicar las penas a los escribanos de cámara que llevaban las causas.

- Controlar los ingresos extraordinarios que se cobran los oficiales del tribunal.

- Asistir a las visitas periódicas a la cárcel que realizan los alcaldes del crimen.