Fue la séptima fundación monástica femenina de la Orden Militar de Santiago. Su origen se remonta al siglo XII, cuando los repobladores procedentes de Toro fundaron la iglesia de Sancti Spiritus en 1190. Al pie del templo se construyó el convento femenino de la Orden de Santiago de la misma advocación, que ya en 1223 era foco de difusión del ideal espiritual de la orden.

En "Historia de Salamanca", Villar y Macías refiere la existencia de un grupo de mujeres de caballeros que, mientras sus esposos estaban ausentes por participar en campañas militares, se retiraban a hacer vida religiosa en la ermita de Santa Ana, permaneciendo allí muchas de las que quedaban viudas, de modo que acabaron constituyendo un beaterio. Hacia 1268 estas mujeres pudieron ser las primeras integrantes de la comunidad de Sancti Spiritus, pero lo apunta con recelo, dado que la tradición de las "beatas de Santa Ana" parece tener su origen en un documento falsificado, presuntamente datado en 1030, por el que Fernando I concedía al convento de Sancti Spiritus de la orden de las religiosas de Santa Ana de Salamanca una encomienda de la Orden de Santiago y una serie de privilegios. Las religiosas consiguieron que este falso fuera confirmado por Felipe II en 1561.

Sin embargo, es posible que esta tradición tenga base real, ya que se sabe que la ermita de Santa Ana existió realmente. Esta se situaba en la puebla de Sancti Spiritus, en una ubicación próxima al lugar en que se edificó el convento del mismo nombre. Además, Bernardo Dorado en su "Compendio Histórico de la ciudad de Salamanca", confirma la existencia de una ermita llamada del Santísimo Cristo de Santa Ana en dicha ciudad, a la que se retiraban las mujeres de los caballeros que acudían a la guerra, permaneciendo allí las que quedaban viudas. El monarca Fernando I dotó de lugares, rentas y privilegios a este beaterio, que acabó convirtiéndose en el convento de Sancti Spiritus de Salamanca.

En el año 1268 Pelay Pérez Correa, maestre de la Orden Militar de Santiago, y el matrimonio formado por Martín Alfonso de León (hijo ilegítimo del rey Alfonso IX de León y Teresa Gil de Soverosa) y María Méndez de Sousa, acordaron en un documento de mutua donación que todos los bienes cedidos por ambas partes se entregasen al convento de Sancti Spiritus de Salamanca (dotación de bienes efectuada entre los años 1268 y 1274). De este modo se cedió a la comunidad de religiosas la puebla y parroquia de Sancti Spiritus, así como importantes propiedades en la provincia de Salamanca y unos señoríos jurisdiccionales extremeños que se convertirían a largo plazo en las propiedades más importantes del convento. De este modo el cenobio ganó una cota importante de autonomía, no sólo por el patrimonio conseguido, sino también por su inserción en la Orden de Santiago, hecho que garantizó la existencia de una comendadora elegida por la comunidad de religiosas, confirmada por el maestre de la Orden, el cual no intervendría en la vida conventual salvo en el ejercicio de su derecho de visita.

Entre los años 1268 y 1379 destacó el patronazgo ejercido sobre el convento por tres mujeres, además de la citada María Méndez de Sousa: la reina María de Molina; la infanta Violante Sánchez de Castilla (hija ilegítima de Sancho IV y María Alfonso de Ucero), que fue primero patrona y luego comendadora de este convento (1326-1330); y la reina Juana Manuel de Villena, esposa de Enrique II de Castilla.

Hasta el año 1500 este convento recibió 17 donaciones más, todas procedentes de diferentes personalidades de la media y baja nobleza. Con el tiempo reunió un importante patrimonio caracterizado por su dispersión geográfica, que ocasionó problemas de gestión y explotación a las religiosas.

Los reyes de Castilla confirmaron los privilegios del cenobio en varias ocasiones y lo protegieron durante sus conflictos con la Orden de Santiago o con el concejo de la ciudad de Salamanca, especialmente entre los años 1459 y 1472, periodo en que la comunidad experimentó usurpación de rentas y ocupación física del espacio.

Aproximadamente en 1566 las religiosas del convento de Santa Clara de Ciudad Rodrigo, que había sido fundado por las comendadoras del cenobio de Sancti Spiritus de Salamanca, se reintegraron temporalmente en su comunidad salmantina de origen, a causa de su negativa a aceptar la observancia de los decretos tridentinos relativos a la clausura (acogían a las hijas de los vecinos para su educación durante un corto periodo de tiempo) y a cumplir los mandatos del obispo Bernardo Sandoval y Rojas. Posteriormente las religiosas regresaron al cenobio mirobrigense.

El 26 de julio de 1786 las religiosas abandonaron este convento debido a su estado ruinoso. Ese mismo año la Orden decidió derribarlo y en 1793 comenzó a construirse un nuevo cenobio. Las obras finalizaron en 1803, pero las religiosas de Sancti Spiritus de Salamanca nunca volvieron a habitarlo. Tras la Guerra de Independencia se pensó utilizarlo como Convento del Rey, aunque no llegó a hacerse.

En el siglo XIX, entre los años 1836 y 1837, el edificio fue desamortizado. En 1843 se habilitó como cárcel, hasta la construcción de la nueva, que tuvo lugar en 1932. En 1962 se convirtió en Archivo Histórico Municipal y funcionó como Escuela de Artes y Oficios hasta 1964. Finalmente se derribó por completo en 1965 con objeto de construir viviendas. Actualmente sólo permanece en pie su iglesia, declarada como Monumento Nacional por Real Orden de 10 de junio de 1888.

Entre los hitos más destacados de la historia del convento de Sancti Spiritus se encuentra el nombramiento, en 1325, de la infanta Violante Sánchez de Castilla, patrona del cenobio, como Comendadora por el papa Juan XXII, accediendo a su petición previa.

El convento presentaba un patio empedrado y un claustro cuadrado de dos plantas de altura con 24 columnas y arcos. Albergaba altares dedicados a la Virgen y el Niño, San Pedro, Santiago Matamoros y San Juan.

Lo único que se conserva del complejo conventual es el templo, ya que el cenobio se reconstruyó a finales del siglo XVIII, quedando únicamente del primitivo edificio una sencilla puerta de arcos apuntados ubicada al norte del actual coro. La obra se realizó siguiendo el proyecto de Manuel Martín Rodríguez, que contó con la colaboración de Ramón Durán. En su construcción y ornamentación también participaron fray Martín de Santiago, el maestro Juan de Álava y Juan Gil de Hontañón.

La iglesia, de estilo gótico-renacentista, consta de una única nave cubierta por bóvedas de combados con arcos fajones apuntados y capiteles moldurados. Las capillas laterales se sitúan entre los contrafuertes, bajo arcos de medio punto, cubiertas por bóvedas de crucería. Las ventanas muestran igualmente trazas renacentistas por el doble mainel y óculo que presentan.

En la capilla mayor destaca el Retablo elaborado por Alonso Martínez y Antonio de Paz en 1644. La iglesia alberga la imagen del Cristo de los Milagros, datada en el siglo XIV, de estilo gótico, que representa a Cristo Crucificado.

El coro se abre a la nave principal del templo mediante una elegante puerta renacentista. Esta estancia posee una sencilla sillería gótica, y se halla ornamentada por un suntuoso artesonado del siglo XVI que conjuga rasgos moriscos y renacentistas.

En el exterior los contrafuertes se encuentran coronados por pináculos que dotan al edificio de un aspecto típicamente gótico, lo cual contrasta con la portada de característico estilo plateresco salmantino.

La documentación de este convento ingresó en el Archivo Histórico Nacional a consecuencia del proceso desamortizador, y actualmente se conserva en la sección de Órdenes Militares